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干细胞关键转录因子Foxd3在宫颈癌组织中的表达

录入:linle    文章来源:网络    点击数:    更新时间:2011-9-1

  Foxd3 是 winged helix / forkhead 转录因子家族中的一员 主要在胚胎干 ES 细胞和胚胎瘤 EC 细胞等多能细胞中表达 1 检测 Foxd3 蛋白表达对寻找干细胞有着很好的指导意义 本研究检测宫颈癌组织中 Foxd3 mRNA 及蛋白的表达 期待寻找出宫颈癌中具有干细胞性质的细胞 为探索宫颈癌的发病机制及治疗方法提供一种新思路

  材料与方法 1.1 材料

  21 例新鲜宫颈癌组织 FIGO 宫颈癌临床病理分期 宫颈鳞状细胞癌Ⅰ期 10 例 Ⅱ期 5 例 宫颈腺癌Ⅰ期 5 例 Ⅱ期 1 例 和 15 例正常的宫颈组织 离体后迅速置-80℃冰箱保存 用于检测 Fodx3mRNA 的表达 组织芯片购于西安超英公司 每张芯片包括 43 例宫颈组织标本年龄范围为 21~71 岁平均 41 岁 取样前未经任何治疗 其中包括 宫颈鳞状细胞癌Ⅰ期 14 例 Ⅱ期 9 例 宫颈腺癌Ⅰ期 5 例 Ⅱ期3例 正常宫颈12 例

  1.2 方法

  1.2.1 RT-PCR

  总 RNA 提取按照 Trizol 试剂盒 美国 Qiagen 公司 说明书提取组织总 RNA 按照反转录试剂盒美国 MBI 公司 说明书在 20 l 的反应体系中合成细胞总 cDNA PCR 体系为 50 l 内含模板 2 l Taq 酶 日本 TAKARA 公司 5 U 目的引物各 1 l 补水至 50 l 反应条件除退火温度外均为预变性 94℃ 4 min 变性94℃ 30 s 退火30 s 延伸72℃ 30 s25 个循环 Foxd3 上游引物为 5′ -AGCGCCAGC- GATATGTCCG-3′ 下游引物为 5′-TGCCAGGGCTT- GCGG TTGA-3′ 退火温度56.5℃

  产物长度为210 bp 内参 -actin 上游引物为 5′-CCAGAGCAAGAGAG- GCATCC-3′ 下游引物为 5′-CCGTGGTGGTGAAG- CTGTAG-3′ 退火温度57.5℃

  产物长度为437 bp 1.2.2 免疫组织化学。

  免疫组织化学都在 4 m 的组织芯片上进行二甲苯脱蜡梯度酒精再水化后 3% 过氧化氢抑制内源性过氧化酶活性 100℃ 0.01 mol / L 枸橼酸钠 pH 6.0 行抗原修复 10 min PBS 冲洗 3 遍 10% BSA 封闭非特异性位点 10 min 一抗鼠抗人 Foxd3 单克隆抗体购于美国 R&D 公司 1︰100 4℃ 孵育过夜 PBS 冲洗 3遍 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠多克隆抗体 美国 Pierce 公司 1︰1000 室温下孵育 1 h PBS 冲洗3遍 DAB 显色 镜下观察 1.3 统计学方法计量资料比较采用 检验 计数资料采用卡方检验 < 0.05 认为差异有显著性意义结果。

  2.1 Foxd3 mRNA 在宫颈癌组织中高表达

  在宫颈癌及正常宫颈组织中 均可检测到 Foxd3 mRNA 表达其在宫颈癌组织的表达水平要高于正常宫颈组织 < 0.05

  2.2 Foxd3 蛋白在宫颈癌组织中的表达。

  无论宫颈鳞状细胞癌还是宫颈腺癌组织 绝大多数都可以检测到Foxd3 蛋白表达 29 / 31 93.5% 其在宫颈癌组织或呈灶状 或表达于单个癌细胞 主要表达于胞浆中 图 2A~D 正常宫颈中 未检测到 Foxd3 蛋白表达 0/12 0% 2E~F Foxd3在宫颈癌组织中的表达几率要高于正常宫颈组织 < 0.05

  Foxd3 在胚胎干细胞多能性的维持中起到了重要的作用该基因是 Sutton 等 2 于 1964 年从 Pcc4 小鼠胚胎瘤 cDNA 文库中分离得到 当时认为它仅在 ES 细胞和相应的胚胎瘤中表达 故将其命名为 Genesis 通过对其氨基酸序列进行分析 发现它属于 winged helix 转录因子家族中的一员最后将其统一命名为Foxd3 2 Hanna 等 3 用 RT-PCR 的方法检测了小鼠早期胚胎组织 从未受精的卵母细胞到受精植入后的早期胚胎组织 中 Foxd3 的表达情况 发现 Foxd3 在卵母细胞和一细胞期没有表达 而在胚泡 blastocyst 阶段开始表达 原位杂交分析发现交配后 6.5 天的胚胎中 Foxd3 在整个上胚层中都有表达 而在胚胎外组织中有弱表达随着胚胎的发育 Foxd3 的表达逐渐消失 3-5 Xu 等 6 研究发现 过表达 Foxd3 的 32D 髓样细胞在粒细胞集落刺激因子的刺激下不发生分化 而是继续增殖 保持其原始状态这些都说明了Foxd3 只在干细胞中表达 对干细胞多能性的维持有着重要的作用 3 5-6 同时 检测其表达是寻找具有干细胞性质细胞的一个好方法。

  人们从乳腺癌 7-8 脑肿瘤 9 肺腺癌 10 前列腺癌 11 卵巢癌 12 中分离出带有干细胞性质的癌细胞后发现其有更强的成瘤性 将其命名为 癌干细胞 在治疗过程中这类细胞大多数处于静止期 因此认为这类细胞才是癌症复发与转移的原因 也是肿瘤治疗真正的靶点 13-17 从此掀起了人们寻找实体瘤中的癌干细胞的热潮 然而 宫颈癌中是否存在宫颈癌干细胞目前还未见相关报道本研究提示了宫颈癌干细胞存在的可能 或者说宫颈癌中存在着干细胞性质的癌细胞 同时 宫颈癌组织中 Foxd3 mRNA 的过表达及其蛋白表达亦说明其可能为宫颈癌治疗的一个潜在靶点.





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