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大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向诱导

录入:linle    文章来源:网络    点击数:    更新时间:2011-9-2

  骨髓间充质干细胞是存在于骨髓组织中多种干细胞的混和体,因其具有取材方便、扩增迅速、可自体移植并且具有多分化潜能等特点近年来越来越受到关注。MSCs 与神经组织修复、骨、软骨组织修复、肌组织、肌腱组织修复以及皮肤创面愈合等都有很密切的关系。

  实验从大鼠骨髓中取出骨髓基质细胞后进行体外原代及传代培养,经过多次传代以获得较纯的 MSCs ,从形态学上观察和鉴定MSCs ,诱导其向神经元样细胞方向分化,证实其具有神经元样分化潜能。 德国病理学家Cohnheim 首先提出在骨髓基质中存在有向非造血系统多向分化的干细胞。1968 年Friedenstein 等首先证实骨髓间充质干细胞在骨髓组织中的存在。近年来,MSCs 的多向分化潜能越来越受到研究者的关注,因其具有取材方便安全、来源丰富、损伤小,易于体外培养扩增,在体外可长时间保持未分化状态,体外基因转染率高,并能稳定高效表达多种治疗性外源基因,而且自体获取的MSCs 回植后不会发生免疫排斥反应等优点 ,骨髓间充质干细胞已经成为重要的组织工程种子细胞,因此随着组织细胞工程学和基因工程学的兴起,骨髓间充质干细胞必将为神经组织修复、骨缺损、创伤愈合等的治疗开辟广阔前景。

  体外获得的MSCs 为各种细胞的混合体,至今尚未形成一套理想的分离纯化MSCs 的方法。目前用于分离MSCs 常用的方法主要有3 种,即贴壁筛选法、流式细胞仪分离法和密度梯度离心法。本实验采用了密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法,在取出兔的骨髓细胞后,用比重为1. 073 的 Percoll 密度梯度分离液分离骨髓细胞,经梯度离心后,由于比重差别能有效地将绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板除去,获得纯度较高的单个核细胞,然后根据MSCs 与血细胞贴壁性能差异,经体外贴壁培养,随换液弃除悬浮生长的血细胞。原代培养贴壁的细胞主要是MSCs ,也可能混有单核细胞、淋巴细胞,利用它们在培养瓶壁的贴壁性不同, 每次传代用0. 25 %胰蛋白酶消化3 - 5 分钟,MSCs 迅速从培养瓶上脱落,而淋巴细胞、单核细胞由于贴附性强仍附于培养瓶壁,严格掌握消化酶的量和消化时间,保证MSCs 在短的作用时间内与培养瓶壁分开,从而使MSCs 得到进一步纯化。

  原代培养骨髓间充质干细胞约24 - 48 小时贴壁,细胞初为淋巴细胞样小圆细胞,24 - 48 小时后贴壁细胞明显增多,并开始分裂增殖,圆形细胞变形伸出伪足。约8 - 10 天可铺满培养瓶壁,细胞逐渐融合成单层。此时细胞为圆形、多角形、梭形或不规则形,呈集落状生长,并出现核分裂相。不传代细胞,可以持续生长,细胞常围绕集落中央呈岛状分布,呈多角形并可重叠生长,并分泌大量基质。传代培养细胞接种后24 小时贴壁,逐渐伸展为梭形、纺锤形、多角形,胞体较原代略膨大,3 - 5 天即可长满。连续传代后,随着传代次数增多,细胞变为形态更均一、排列更有序的成纤维细胞样。向神经元方向诱导中,bFGF 作为预诱导剂可能参与骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化的启动,纤维生长因子家族成员在胚胎干细胞分化为神经干细胞中起重要作用,而且bFGF 对神经干细胞的增殖也有作用。正式诱导时加入的BHA、DMSO 均为强抗氧化剂,其对骨髓MCSs 定向诱导作用与其能将细胞从氧化状态中释放出来有关。成神经元诱导24 小时后,多数MSCs 变为典型的神经元样细胞,其胞体向胞核收缩成锥形且变得致密而有折光性,有较多的长突起,有些长突起末端形成长锥样的膨大及丝状伪足。免疫组化鉴定显示神经元特异性标志NSE、神经巢蛋白Nestin 染色阳性。说明MSCs 具有体外向神经元样细胞的分化潜能,为今后开展神经干细胞移植修复受损神经组织奠定了基础。





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