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肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白

录入:linle    文章来源:网络    点击数:    更新时间:2011-9-2

  骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是骨髓内造血干细胞以外的非造血干细胞,研究证明, BMSCs具有高度可塑性,在特定环境下除可以分化为中胚层组织外,还可跨越胚层界限分化为外胚层以及内胚层的组织细胞。 BMSCs在体内外转化为肝细胞的研究结果为肝细胞移植治疗终末期肝衰竭带来了新的希望。实验研究分离人BMSCs,并采用肝细胞生长因子(hepatocytes growth factor, HGF) 为诱导剂诱导培养BMSCs,从基因、蛋白水平检测肝细胞系特异性标志物甲胎蛋白和白蛋白的表达, 探讨HGF对其诱导分化作用, 为 MSCs向肝细胞分化选择最适微环境,为临床应用自体BMSCs治疗终末期肝病提供实验基础和理论依据。

  目前BMSCs的分离主要有4种方法:贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠法。在本实验中,把密度梯度离心与贴壁培养法相结合,用淋巴细胞分离液对骨髓做梯度离心,除去绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板,获得纯度较高的单个核细胞,再根据贴壁性差异,纯化 BMSCs。结果显示,分离培养的细胞体积小,呈梭形,核浆比大,体外生长状态稳定,连续传代培养9 代,细胞形态无明显变化,无衰老征象;传代细胞潜伏期短,增殖迅速,培养时间短;免疫组织化学结果显示,3代细胞表达CD105和CD166,表达阳性率几乎为百分之百;用含20%马血清的低糖DMEM培养基诱导培养,MSCs发生形态变化且败将内出现大量脂肪滴,说明本实验实现了BMSCs向脂肪细胞的定向分化。

  BMSCs有多种分化潜能,有研究表明,在特定的诱导条件下BMSCs可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、神经细胞和肝细胞等。在细胞分化的特定条件下,多数细胞均有其细胞骨架的特定组分或产生特定代谢的酶,这些蛋白在各细胞中表现出它的组织特异性。甲胎蛋白和白蛋白均为肝细胞系较为特异的标志,甲胎蛋白是不成熟肝细胞的标志, 白蛋白是最常用和可靠的一个肝细胞功能的检测标志,白蛋白主要有肝细胞合成和分泌,其他细胞分泌极少,用SP方法很难检测到[30]。实验采用HGF诱导培养MSCs,SP结果显示,对照组细胞不表达甲胎蛋白和白蛋白,经含20 μg/L HGF和10 μg/L bFGF的条件培养基诱导培养的MSCs呈类上皮样细胞,培养7 d,大部分细胞甲胎蛋白呈阳性表达,随着培养时间延长甲胎蛋白表达减弱;培养7 d,仅少数细胞白蛋白呈阳性表达, 随着培养时间延长白蛋白表达逐渐增强; RT-PCR结果显示,HGF诱导组MSCs在培养7 d即表达白蛋白 mRNA表达,且随诱导培养时间延长白蛋白呈表达增加趋势,对照组MSCs无白蛋白 mRNA表达,表明20 μg/L HGF和10 μg/L bFGF能够诱导MSCs定向分化为肝细胞样细胞,而且分化的表达肝细胞系特异性标记甲胎蛋白和白蛋白,具有肝细胞合成白蛋白的功能。

  综上所述,实验结果表明,HGF可以诱导BMSCs 分化为肝细胞样细胞,表达肝细胞系特异性标记甲胎蛋白和白蛋白。但实验尚处于对BMSCs向肝细胞样细胞分化的初级阶段,尚有许多工作和技术难点需要进一步探讨,如何诱导MSCs分化为完全意义上的肝细胞,以便更有效的改善肝组织结构和功能,其相关研究工作正在进行之中。





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