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携带人胰岛素基因慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞的实验研究

录入:linle    文章来源:网络    点击数:    更新时间:2011-9-5

  组织工程脂肪构建的关键因素是种子细胞和调控细胞生长分化的细胞因子。目前,作为脂肪组织工程种子细胞的MSCs 主要来源于骨髓,但其取材时需行骨髓穿刺,给患者带来痛苦;同时,随着年龄增长 BMSCs 数量及扩增、分化能力明显下降,并存在病毒污染的可能。因此,寻找新的种子细胞及提高诱导成脂效率成为研究热点。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)可在体外分离、扩增培养,经诱导分化为脂肪细胞,是新的脂肪组织工程种子细胞。本实验构建含人胰岛素(insulin)基因的慢病毒载体,并将其转染进入hUCMSCs,利用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fl uorescent protein,EGFP)基因实现目的基因在体内外表达的示踪定位,为今后组织工程脂肪的构建与体内回植研究奠定基础。

  脂肪组织工程的首要问题是脂肪细胞的成活和吸收。种子细胞的选择是脂肪组织工程的关键因素,合适的种子细胞可以通过诱导因子的作用,促进其向脂肪细胞分化。hUCMSCs 是一类来源于中胚层的MSCs,取材方便,易于分离培养,具有多向分化能力,可分化为脂肪细胞,更主要的是其细胞增殖分裂模式容易使外源基因导入和表达,因此其成为脂肪组织工程理想的种子细胞。

  人insulin 是胰岛β 细胞受内源性或外源性物质刺激而分泌的一种蛋白质激素。hUCMSCs 在成脂诱导试剂的作用下可分化为脂肪细胞,诱导液包括insulin、地塞米松、3- 异丁基-1- 甲基黄嘌呤、吲哚美辛,诱导剂的重要成分为insulin。在β 细胞的细胞核中,mRNA 从细胞核移向细胞浆的内质网构成前胰岛素原;前胰岛素原经过蛋白水解作用于前肽,合成胰岛素原;胰岛素原随细胞浆中的微泡进入高尔基体,经蛋白水解酶的作用生成insulin,分泌到B 细胞外,进入血液循环中。

  基因技术和表达载体的选择也是实现 insulin 基因转染hUCMSCs 后构建组织工程脂肪的关键。目前研究较多的是用携带胰岛素原基因的pCDNA -3.1 等质粒及腺病毒转染靶细胞,经检测证实有胰岛素原分泌[。胰岛素原与细胞表面受体结合力和生物结合性仅为insulin 的5%,应用腺病毒等载体会出现一些免疫应答反应,进行体内实验有一定的风险。为减少不必要的副作用,可应用慢病毒为表达载体,应用第3 代慢病毒系统包装293T 细胞生成病毒颗粒,通过脂质体进行转染,对于干细胞,能大大提高目的基因转导效率,转染率达90% 以上。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。为了能实现重组人insulin 体内外的定位和跟踪,本实验选择了构建含EGFP 的pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP 慢病毒表达载体,选择构建该载体基于以下几点考虑: ①从结构上看,应用PCR 反应可在目的基因上游加上 BamH Ⅰ(GGATCC),下游加上Asc Ⅰ(GGCGCGCC) 2 个酶切位点。② PMD18-T Vector 是一种高效克隆 PCR 产物的专用载体,可以大大提高PCR 产物的连接、克隆效率。③ pLenti6.3/v5 DEST-IRES-EGFP 慢病毒表达质粒是由pLenti6.3/v5 DEST 慢病毒表达质粒改造,将attR1 和attR2 间的序列换成IRES-EGFP,特点为含有绿色荧光蛋白基因,翻译出来的绿色荧光蛋白和目的基因不是融合蛋白,其各具独立空间结构和生理活性,互不干扰并方便目的基因的表达鉴定及定位追踪。本实验构建的pLenti6.3/v5 DEST-IRESEGFP 慢病毒表达载体,荧光倒置相差显微镜下见大量绿色荧光,表明已有大量质粒转染入293T 细胞,成功包装病毒颗粒,并能够在真核细胞中实现稳定分泌人 insulin 的目的。

  通过实验观察和转染效率研究,当MOI 为10 时,可获得较高的转染效率。转染48 h 后荧光倒置相差显微镜下观察到hUCMSCs 细胞内报告基因产物的绿色荧光,表明转染组细胞合成insulin,并随时间推移逐渐升高。由此可知,insulin 基因已经通过慢病毒载体成功导入hUCMSCs。同时,采用QPCR 和Western blot 方法分别从基因和蛋白水平对目的基因表达insulin 情况进行定量检测。QPCR 检测示转染组中insulin 基因表达明显高于未转染组。Western blot 检测示转染组细胞裂解液中insulin 蛋白表达阳性,说明转染组细胞合成目的蛋白;转染组细胞上清液中insulin 蛋白表达阳性,说明转染组细胞分泌insulin 蛋白到细胞外液;未转染组insulin 蛋白表达均为阴性。实验在蛋白水平上进一步标明insulin 基因已成功转入hUCMSCs 并成功合成和分泌insulin。

  综上述,本实验结果表明构建的携带人insulin 基因的慢病毒载体转染hUCMSCs 后具有合成和分泌insulin 的能力,并获得了转染insulin 基因的hUCMSCs,还可以利用绿色荧光蛋白实现目的基因在体内外表达的示踪定位,为下一步利用转染的hUCMSCs 细胞构建组织工程脂肪的实验研究奠定理论基础。





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