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NMDA受体拮抗剂作用与剂量的关系

录入:linle    文章来源:网络    点击数:    更新时间:2011-11-25

  中枢神经系统( central nervous system, CNS)损伤后神经元难以再生的客观事实长久以来一直是令神经科学工作者困惑的问题。1989年Anderson等[ 1 ]最早在实验中首先证实了NSCs ( neural stem cells,神经干细胞)的存在,对实现神经元再生,修复缺失的神经网络环路,以及为脑卒中后遗症的彻底治愈带来了新的希望。近年来大量国内研究对利用内源性NSCs来治疗脑梗死予以很大的关注。应用NMDA (N2methyl2D2aspartate, N2甲基2D2天冬氨酸)受体拮抗剂可减少脑梗死的面积,对神经元具有一定的保护作用。同时兴奋性氨基酸可以通过NMDA 受体激活内源性NSCs,促使其增殖、分化,达到修复丧失神经功能的作用。那么,如何控制NMDA受体活化的程度,使其对神经元的保护作用和对内源性NSCs的激活达到最合适的配比关系? 本实验(2006—2008年)通过腹腔注射NMDA受体拮抗剂 MK2801进行干预,用免疫组化的方法观察梗死灶附近皮质的 Nestin (巢蛋白)阳性细胞数目,探讨MK2801的浓度与内源性 NSCs数目之间的关系,为临床治疗和预防脑梗死寻求实验室基础。

  1 材料与方法

  1. 1 实验动物和分组 选用健康雄性SD 大鼠60 只,体重 250~300 g,随机分为正常组(6只) 、假手术对照组(6只) 、手术对照组(12只)和MK - 801不同剂量组(0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、 1. 0、1. 2 mg/kg) (36只) 。制作大脑中动脉缺血动物模型,不进行缺血再灌注。在模型制作前30 min按照不同剂量组腹腔注射MK2801 (晶美试剂公司提供) ,在术后第7天处死大鼠。

  1. 2 动物模型建立 参照Bederson方法,采用线栓法造成左侧大脑中动脉闭塞。

  1. 3  病理组织观察 将脑组织做成连续冠状冰冻切片,行 Nissl染色,观察病理改变。

  1. 4 切片制备 动物用10%水合氯醛( 3 ml/kg)腹腔注射麻醉后,开胸,经左心室插管至升主动脉,用生理盐水、多聚甲醛磷酸缓冲液灌注,注毕立即开颅取脑,放入4%多聚甲醛行后固定过夜,于颞叶连续冰冻冠状切片,分别行Nestin免疫组化染色、常规尼氏染色,并设阴性对照。

  1. 5 Nestin免疫组化染色 用SABC法,一抗兔抗大鼠Nestin 多克隆抗体(武汉博士德公司提供) 。

  1. 6 图像分析 采用HP IAS - 2000图像分析系统,对梗死灶附近皮质放大200倍进行分析,每张切片对应部位取15个视野,计数出每个视野的Nestin阳性细胞数目。

  1. 7 统计处理 用t检验及方差分析,比较各组之间Nestin阳性细胞的数目, P < 0101为具差异有统计学意义。





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