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脂肪间充质干细胞向髓核样细胞诱导分化的初步研究

录入:linle    文章来源:网络    点击数:    更新时间:2011-11-25

  椎间盘退变性疾病在临床上甚为常见, 随着社会的老龄化, 其发病率逐渐升高。现行的治疗包括保守治疗和手术治疗, 或通过暂时降低椎间盘轴向载荷缓解症状, 或通过去除退变椎间盘组织减压或稳定脊柱等手段进行处理, 由于并未针对椎间盘退变的关键因素—退变所致的髓核细胞数量的减少及继发细胞外基质中蛋白聚糖的减少, 因此无法修复其结构。而干细胞移植治疗通过补充椎间盘内因退变所致的髓核细胞数量的减少, 促进髓核细胞外基质的形成, 修复退变椎间盘的结构, 重建其功能, 显示出良好的应用前景。脂肪间充质干细胞, 因其来源丰富, 获取方便而组织损伤小, 体外增殖迅速, 免疫原性低, 且同样具有向脂肪、骨、软骨、神经等组织多向分化的潜能, 近年来备受关注。本研究旨在分离、纯化、鉴定脂肪间充质干细胞的基础上, 定向诱导其向髓核样细胞分化, 为椎间盘退变性疾病的生物学治疗奠定基础。

  1 材料与方法

  111 材料

  雄性SD大鼠(200 g) 购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。混合型胶原酶( Sigma) 、胰蛋白酶( Sigma) 、 DMEM /F12 培养基( Hyclone ) 、DMEM /HG 培养基( Hy2 clone) 、胎牛血清(Hyclone) 、总RNA 提取试剂盒( TIAN2 GEN) 、引物( invitrogen ) 、RT2PCR 试剂( TOYOBO ) 、ITS liquidMedia Supp lement (100 ×) ( Sigma) 、Alcian Blue 8 GX ( Sigma) 、地塞米松( Sigma) 、海藻酸钠( Sigma) 、F ITC标记抗体( Pep rortech) 、转化生长因子(R&D) 。

  112 方法

  11211 脂肪间充质干细胞的分离、极限稀释法纯化 SD大鼠断颈处死后, 仔细分离腹股沟脂肪垫处脂肪组织, 尽量剔除筋膜组织及淋巴结。取脂肪组织1 cm3 , PBS洗3遍, 剪碎后2 000 r/min离心10 min, 保留上层脂肪组织, PBS重悬后 2 000 r/min离心10 min。上层脂肪组织加入4 ml 011%胶原酶溶液(用含10% FBS的DMEM /F12 培养基配制) , 置于 37℃ 5% CO2 培养箱内消化2 h, 每半小时摇匀一次。消化好的组织液1 500 r/min离心5 min后弃上清, PBS重悬, 1 500 r/min离心5 min, 弃上清。加入含有10% FBS、100 IU /100 ml青霉素、100 ug/100 ml链霉素的DMEM /F12培养基4 ml, 接种于96孔板内。24 h后第1次换液, 去除未贴壁细胞, 以后每3 d换液1次。原代融合后, 挑选成纤维样的梭形细胞克隆用0125%胰蛋白酶溶液消化传代。

  11212 脂肪间充质干细胞的鉴定 第3代细胞以0125%胰蛋白酶溶液消化, 用含血清培养基终止消化。计数后离心, 弃上清, PBS重悬, 使每个115 ml Eppendorf管内含有1 ×106 个细胞; PBS洗涤2遍; 室温下与F ITC直接标记的抗体anti2 rat Sca21 ( 1: 200 ) 、anti2rat CD44 ( 1: 200) 、anti2rat CD45 (1: 200) 、anti2rat CD11b ( 1: 200) 孵育1 h; 离心, 弃上清; PBS洗涤两遍; 加300 ul PBS, 用流式细胞仪对细胞表面抗原Sca21、CD44、CD45、CD11b进行检测。

  11213 实验分组 (1) 对照组A: 微球联合培养+普通培养基+ 21%O2 ; (2) 对照组B: 微球联合培养+诱导培养基 + 21%O2 ; ( 3) 实验组C: 微球联合培养+诱导培养基+ 2%O2。

  11214 培养基的配制 普通培养基: DMEM /HG, 10% FBS。诱导培养基: DMEM /HG, 10% FBS, 10 ng/ml转化生长因子 ( TGF2β1 ) , 100 nmol/L 地塞米松, 50 ug/ml抗坏血酸, 100 ug/ml丙酮酸钠, 40 ug/ml脯氨酸以及ITS2p remix。

  11215 与海藻酸钠微球联合培养、诱导分化 第3代细胞用0125%胰蛋白酶溶液消化后, 计数、离心, 用112%海藻酸钠溶液进行重悬, 调整细胞密度至1 ×106 /ml。用22G注射器在315%CaCl2 溶液液面上方2 cm处缓慢匀速滴下, 室温下孵育10 min以形成直径2 mm的微球。PBS洗3遍。实验组加入诱导培养基, 置于37℃ 2%O2 的三相培养箱内培养。对照组分别加入诱导培养基和普通培养基置于37℃ 5% CO2培养箱内培养。每2 d换液一次。诱导7 d。7 d后, 吸掉培养液, 部分微球用于Alcian Blue染色; 其余用55 mM柠檬酸钠溶液(用019%NaCl溶液配制) 溶解, 释放出微球内细胞。1 500 r/min离心5 min, 弃上清; PBS重悬, 1 500 r/ min离心5 min, 弃上清; 细胞用于提取RNA。

  11216 Alcian Blue染色 从诱导培养基组(B、C组) 取部分微球用PBS洗3遍; 室温下用Kalhes固定剂(6 ml福尔马林, 15 ml 95%乙醇, 1 ml冰醋酸, 80 ml双蒸水) 固定20 min; 50%乙醇洗涤; 70%乙醇洗涤; 1% Alcian Blue 溶液 (1 g Alcian Blue 8 GX, 100 ml 3% 醋酸溶液) 固定30 min; 双蒸水洗涤3遍; 倒置显微镜下观察, 数码相机拍照。

  11217 总RNA的提取 每组微球内释放出的细胞, 分别加入1 ml TRNzol2A + , 混匀后移入去除RNA酶的115 ml EP管, 室温静置5 min; 加入012 ml氯仿, 充分混匀后室温静置3 min; 12 000 r/min离心15 min, 取上层水相400 ul至另一去除RNA酶的115 ml EP管; 加入等体积异丙醇, 室温放置10 min; 12 000 r/min离心10 min, 弃上清; 加入1 ml冰浴的 75%乙醇洗涤沉淀(用DEPC处理水配制) ; 7 500 r/min离心5 min, 弃上清; 加10 ul DEPC处理水溶解沉淀; 取2 ul 稀释至200 ul, 用分光光度仪测RNA浓度及纯度。

  11218 逆转录聚合酶链式反应(RT2PCR)  采用两步法。 RT步骤为: 2 ul Oligo ( dT) 引物, 1 ~ 2 ug 总RNA, 加 DEPC处理水至12 ul; 70℃ 5 min; 4 ul 5 ×RT buffer, 2 ul dNTP (10 mM) , 1 ul RNaes Inhibitor, 1 ul RTAce; 42℃ 1 h; 95℃ 5 min。PCR步骤如下: 5 ul 10 ×Taq Buffer, 015 ul dNTP (10 mM) , 015 ul上游引物(20 uM) , 015 ul下游引物( 20 uM) , 2 ul cDNA, 015 ul Taq polymerase, 加ddH2O至25 ul; 94℃ 5 min; 94℃ 45 s; 55℃ 45 s; 72℃ 1 min; 30 个循环; 72℃ 10 min。PCR产物用115%琼脂糖凝胶, 电压100 V, 电流50 m I, 电泳25 min。上样量均为5 ul。凝胶成像分析系统拍照分析。





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