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微管蛋白2Ⅲ在脊髓神经干细胞向神经元定向分化早期的动态变化

录入:linle    文章来源:网络    点击数:    更新时间:2011-11-25

  脊髓神经干细胞定向分化为神经元的过程,实际上也是神经元生长发育的过程,其各组成部分会以一定的规律发育。其中起重要作用的是细胞骨架,它不仅维持细胞的形态,而且与细胞的运动、物质转运、能量转换、信息传递以及细胞分裂和分化、基因表达等重要生长活动有关。细胞骨架蛋白在细胞内必须保持合理的空间配布,相互协调才能确保细胞的生命活动过程有序地进行。因此,神经干细胞向神经元分化时,细胞骨架蛋白的表达也将受到严格的时空控制。β2微管蛋白2Ⅲ(β2tubulin2Ⅲ)作为细胞骨架家族成员之一,它是神经细胞的特异性微管蛋白,已被认为是神经元早期发育的标志,但是在神经干细胞定向分化为神经元过程中表达的变化鲜有报道。因此,本研究通过对β2微管蛋白2Ⅲ表达的定位、定量改变的分析,以助于进一步了解由神经干细胞分化的神经元发育及突起生长的机制。

  一、材料

  11实验动物:出生24 h之内的Wistar大鼠,雌雄兼用(体重为4~6 g,由沈阳医学院动物室提供) ,分别取10只大鼠的脊髓同时进行细胞培养,共4次,共计 40只。

  21主要试剂: 10%胎牛血清、0125%胰酶2Hank′s液、DMEM /F12、B27 ( b227 serum2free supp lements) 、碱性成纤维细胞生长因子( bFGF) 、表皮生长因子 ( EGF) 、脑源性生长因子(BDNF) 、神经生长因子(NGF)均购自Gibco公司;兔抗鼠巢蛋白( nestin)抗体、兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司; HRP标记的羊抗小鼠IgG购于北京中杉金桥生物工程公司;小鼠抗大鼠甘油醛232磷酸脱氢酶( GAPDH)抗体,羊抗中华临床医师杂志(电子版) 2009年10月第3卷第10期 Chin J Clinicians(Electronic Edition) ,October 15, 2009,Vol. 3,No. 10 ·1691· 小鼠的Cy3购自Sigma公司;小鼠抗大鼠β2微管蛋白2Ⅲ抗体购自Santa公司。

  二、方法

  11神经干细胞原代及传代培养:无菌取新生大鼠的脊髓,置于Hank′s液中, 漂洗,剪碎, 移至离心管内; 加入0. 25%胰蛋白酶, 37 ℃, 消化25 min; 加入 DMEM /F12无血清培养基终止消化,机械吹打、分离细胞,经四层无菌纱布过滤; 1 100 g离心5 min; 弃上清, 加DMEM /F12 无血清培养基, 其内含有bFGF (20 ng/ml) 、EGF (20 ng/ml) 和B27 (50 ×) ;用台盼蓝染色法测定细胞活性,将细胞悬液浓度调整为(1~5) ×106 个/ml,接种于75 ml的培养瓶中,置于37 ℃, 5% CO2 培养箱内孵育。每2 d半量换液一次,用倒置相差显微观察并照相。将原代培养7 d形成的神经球与培养液一起收集至离心管中,以300 g离心5 min, 加入上述培养液,吹打成单细胞悬液,仍以上述密度种植于培养瓶内,置于37 ℃, 5% CO2 培养箱内孵育,每2 d半量换液一次。

  21神经干细胞鉴定:神经干细胞培养7 d后,取生长良好的神经球细胞悬液滴加于经多聚赖氨酸处理过的盖玻片上,风干。4%多聚甲醛固定20 min, PBS液 (内含0. 03% Triton X2100)破膜, PBS漂洗, 3% H2O2 浸泡10 min, PBS漂洗,正常山羊血清封闭, 滴加nestin (1∶200)多克隆抗体4 ℃过夜,随后依次加生物素化二抗和ABC复合物,DAB 显色,显微镜下控制反应时间,蒸馏水洗,系列乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。对照组用0. 01 mol /L PBS代替一抗。Olympus 光学显微镜观察、摄片。

  31神经干细胞诱导分化:神经干细胞培养7 d后,收集细胞悬液置于离心管, 550 g离心5 min;弃上清,加DMEM培养基,内含10%胎牛血清、BDNF (2 ng/ml) 和NGF (10 ng/ml) ,机械吹打制成单细胞悬液,将细胞悬液浓度调整为1 ×106 个/ml,种植于经多聚赖氨酸处理,内置盖玻片的6 孔培养板中, 2 ml /孔,置于 37 ℃, 5% CO2 培养箱内孵育。每2 d半量换液一次,用倒置相差显微观察并照相。

  41神经元鉴定:在神经干细胞诱导分化第7天的培养皿中取出盖玻片,用 4%的多聚甲醛固定,进行NSE (1∶400)免疫细胞化学染色( SABC法) 。Olympus 光学显微镜观察、照相。同时,用0101 mol /L PBS代替一抗作阴性对照实验。 51β2微管蛋白2Ⅲ免疫细胞荧光技术及图像分析:在神经干细胞诱导分化第 1、4、7天的培养皿中取出盖玻片,用4%的多聚甲醛固定,依次用含0103% Triton X2100的PBS漂洗10 min ×3 次, 5% BSA 封闭20 min后,滴加β2微管蛋白2Ⅲ (1∶300)和0101 mol /L PBS代替一抗作阴性对照, 4 ℃孵育过夜, 0101 mol /L PBS 漂洗,滴加羊抗鼠的Cy32IgG (1∶100)室温2 h, PBS漂洗、50%甘油封片,荧光显微镜下观察β2微管蛋白2Ⅲ表达,摄片。

  图像分析:随机从神经干细胞诱导分化后第1、4、7天的培养皿中取出载玻片,各10张,经免疫细胞化学染色后,采用Scion Image Analysis System进行图像分析,在高倍镜( ×400)视野内测每个细胞的光密度值,每张切片选5~6 个细胞,计算各积分光密度值( IOD) 。





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