设为首页加入收藏网站地图在线咨询

您现在的位置: 干细胞科学网 > 专家园地 > 专家讲坛 > 正文

不同细胞因子体外诱导神经干细胞向神经细胞分化的研究

录入:linle    文章来源:网络    点击数:    更新时间:2011-11-25

  神经干细胞因具有高度自我更新能力、多分化潜能、低免疫原和迁移功能等特性 ,在治疗急、慢性神经系统损伤及多种神经系统疾病如多发性硬化症、阿尔茨默氏病、帕金森病、亨廷顿病和缺血性脑损伤等方面具有广阔的临床应用前景。近年研究表明神经干细胞在体外存活和分化受诸多因素影响。笔者模拟体内多种细胞因子协同作用进行体外诱导,观察体外不同细胞因子诱导神经干细胞向神经细胞分化比例的差异。

  1 材料与方法

  111 实验材料

  11111 实验动物 清洁级成年( 6 个月龄) SD 雄性大鼠5 只,体质量200~220 g,由广西医科大学医学实验动物中心提供,实验动物生产许可证号SCXK桂200320003,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

  11112 主要试剂 DMEM /F12 ( 1 ∶1, Hyclone 公司) ; B27 (Gibco公司) ;碱性纤维母细胞生长因子( bFGF) 、白血病抑制因子(L IF) 、脑源性神经营养因子(BDNF)均购于pep rotech 公司; 胎牛血清( FBS) (Hyclone 公司) ; 异硫氰酸荧光素 ( F ITC) 2羊抗兔IgG、兔抗2巢蛋白(Nestin) 、兔抗2神经元特异烯醇化酶(NSE) 、即用型链霉卵白素2生物素2酶复活物法 (SABC)试剂盒、破膜剂均购于武汉博士德公司;多聚赖氨酸、胰蛋白酶购于Sigma公司。

  112 实验方法

  11211 神经干细胞原代培养 根据郑志竑,乌优图等建立的培养方法基础上适当改进。将成年SD大鼠脱臼处死, 无菌条件下完整取出脑组织,仔细剥离去掉脑膜,切除鼻裂之前以及海马之后的脑组织,再将鼻裂与海马之间脑组织周围皮质切除,得到含高密度神经干细胞的侧脑室周围和海马组织,用无菌D2Hanks液清洗1 min。眼科剪刀剪碎脑组织至1 mm大小,再加入011%胰蛋白酶10 ml, 37 ℃下消化3 min。然后加入2~3倍体积的血清终止胰蛋白酶的消化, 4 ℃下以 1000 r/min,离心5 min,弃上清液,反复2~3次避免胰蛋白酶的残留。加入DMEM /F12 /B27培养基15 ml轻轻吹打将沉淀物制成悬液,先后用200目和400目的不锈钢滤筛过滤此悬液,最终得到较为纯净的脑组织单细胞悬液。计数细胞,求得细胞浓度。以DMEM /F12培养基稀释细胞悬液至所需浓度1 ×108 /ml。分置于3~5个25 ml培养瓶中,并于每瓶中加入 20μg/L的碱性纤维母细胞生长因子,于37 ℃、体积分数为 5% CO2 的培养箱中培养。原代培养每隔1 d半量换液1次, 隔4 d传代。

  11212 神经干细胞传代 收集细胞, 离心1000 r/ min, 5 min,弃上清液,细胞沉淀中加入01125%的胰酶, 37 ℃消化15 min,毛细吸管反复吹打,将克隆球吹打成单细胞悬液,置于 35 mm 培养皿中,加入DMEM /F12 /B27培养基+ 20μg/L的碱性纤维母细胞生长因子,调整细胞密度,放入37 ℃, 5 % CO2 的培养箱中培养。

  11213 神经干细胞鉴定 根据王振宇等方法基础上适当改进。取第3代细胞100倍镜下克隆球直径约为200μm时, 进行单细胞克隆。0125%的胰蛋白酶于37℃消化5 min, Pas2 teur吸管吹打,镜下观察,细胞分散后,离心,用DMEM /F12 + 2% B27 + bFGF (20μg /L) +条件培养液(细胞原代培养第7 天的上清液的过滤液) 悬起沉淀,吸管吹打成单细胞悬液,台盼蓝计数活细胞比例,有限稀释法稀释细胞到5 个/ ml,于96 孔板内滴加稀释后的单细胞悬液, 200 μl/孔,每天观察细胞增殖情况。单细胞克隆形成的克隆球进行传代培养。待大多数克隆球100倍镜下直径为200μm时,部分克隆球放置在涂有多聚赖氨酸的孔板中生长4 h 后, 4%多聚甲醛固定,进行巢蛋白免疫细胞化学染色。





我要咨询
更多>>专家推荐
  • 葛汝村简介

    葛汝村简介

    发育生物学专家,山东省交通医院细胞治疗中……

  • 李芳

    李芳

    儿科主任,主任医师,全军儿科专业委员会委……

  • 吕涌涛简介

    吕涌涛简介

    山东省交通医院副院长,主任医师,硕士生导……

更多>>权威医院

| 设为首页 | 加入收藏 | 联系站长 | 粤ICP备07073042号 | 友情链接 | 版权申明 | 联系我们 |

特别声明:本站内容仅供参考,不作为诊断及医疗依据。 本站所有内容严禁转载,转载需和管理员联系。

互联网医疗卫生信息服务许可证[粤卫网审字(2008)第17号] 常年法律顾问机构:北京市中伦金通律师事务所。