设为首页加入收藏网站地图在线咨询

您现在的位置: 干细胞科学网 > 专家园地 > 文献荟萃 > 正文

豚鼠脂肪干细胞的分离培养与鉴定

录入:linle    文章来源:网络    点击数:    更新时间:2012-1-30

  目的: 从成年雄性豚鼠脂肪中分离培养脂肪干细胞,为脂肪干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。

  方法: 实验于2005- 12/2006- 03 在河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室完成。成年雄性豚鼠, 体质量500~750 g。分离培养豚鼠脂肪组织, 培养三四天后首次换液。倒置显微镜下观察有大量细胞贴壁和漂浮的血细胞, 用磷酸缓冲液反复冲洗去除漂浮的细胞, 加入DMEM基础培养基+10%胎牛血清培养液。传代前用少量磷酸缓冲液洗涤1 次, 加入0.25%胰蛋白酶和 0.02%乙二胺四乙酸2 mL,见大部分细胞胞质回缩、形态变圆, 加入2 mL 含血清的DMEM培养液终止消化, 收集细胞悬液、计数, 以2×104/cm2 细胞密度接种于新的培养皿内。二三天达到融合状态, 继续传代培养。四甲基偶氮唑蓝测定第1、3、10 代脂肪干细胞生长曲线, 流式细胞仪检测脂肪干细胞表面标志。

  结果: ①原代培养显示培养的脂肪间充质干细胞2 d 左右开始贴壁,7 d 左右可达90 %融合,基本上为梭形成纤维样细胞形态。 ②生长曲线显示, 豚鼠脂肪干细胞在1~3 代增值能力较强,以第1 代细胞最强,10 代以后增殖能力减弱,细胞生长进入平台期。经消化传代后的第1、3、10 代细胞均经历24~48 h 的潜伏期,此后为3~5 d 对数生长期,逐渐进入生长平台期。14 代以前具有活跃的增殖能力。③脂肪干细胞标志CD105,CD44 呈阳性表达, 而造血干细胞标志CD34 阴性表达。

  结论: 成功地建立了一种分离培养豚鼠脂肪间充质干细胞的方法,其生长稳定、增殖较快,可作为干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。

  0 引言

  研究发现, 胚胎干细胞也可以在体外及体内转化为内耳毛细胞[1- 4]。大量研究表明, 神经干细胞体内外均可分化为类毛细胞并表达毛细胞标志物[6- 12]。神经干细胞取材的特殊性限制了临床工作的进一步发展。Naito[13]、葛圣雷等[14]将豚鼠骨髓基质干细胞经耳蜗底周骨阶钻孔注入内耳, 10 d 后骨髓基质干细胞成活并贴壁生长, 并诱导分化为神经源性细胞。传统的取骨髓方法会带来一些痛苦, 需要全麻或椎管内麻醉, 并且基质干细胞细胞数量少 ( 1/10 万) 。豚鼠是氨基甙类药物中毒性耳聋动物模型的首选动物, 且经过几十年研究已建立了成熟的动物模型。本实验针对上述问题, 进一步完善了豚鼠脂肪干细胞分离方法。

  1 材料和方法

  设计: 观察性实验。

  单位: 郑州大学第一附属医院耳鼻咽喉科。

  材料: 实验于2005- 12/2006- 03 在河南成。成年雄性豚鼠, 体质量500~750 g( 由河南省实验动物中心提供, 动物来源于华中科技大学同济医学院实验动物学部, SCXK 鄂 ( 2004-0007) ) 。

  设计、实施、评估者: 实验的设计、实施及评估由全体作者完成, 均经过正规培训, 双盲法评估。

  方法: 脂肪干细胞的分离培养: 体积分数 0.1 的水合氯醛麻醉豚鼠, 置体积分数0.75 的乙醇中浸泡5 min, 无菌条件下于腹股沟平行切开3 cm, 获取脂肪; 使用同体积的磷酸缓冲液仔细清洗取出大块血液、血管; 37 ℃时, 加入等体积0.075%Ⅰ 型胶原酶消化90 min ( 轻微摇动) ; 加入同体积DMEM +10% FBS 培养液中和消化液, 200 目滤器过滤, 低速 1 300 r/min 离心15 min, 获得高密度的细胞沉淀物, 轻轻倾去上清液和漂浮的**组织, 将细胞振荡混匀; 再次离心去除上清后制成单细胞悬液, 椎虫蓝染色计数, 调细胞密度约为 4×108 L- 1 , 接种于25 cm2 玻璃培养瓶中, 放入体积分数0.05 的CO2、37 ℃条件下培养箱中培养。

  传代培养: 培养三四天后首次换液。倒置显微镜下观察有大量细胞贴壁和漂浮的血细胞, 用PBS 反复冲洗去除漂浮的细胞, 加入 DMEM+10%FBS 培养液。每周换液2 次, 细胞融合至80%传代。传代前用少量磷酸缓冲液洗涤1 次, 加入0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸2 mL, 见大部分细胞胞质回缩、形态变圆, 加入2 mL 含血清的DMEM培养液中止消化, 收集细胞悬液、计数, 以2×104/cm2 细胞密度接种于新的培养皿内。二三天达到融合状态, 继续传代培养。

  四甲基偶氮唑蓝检测: 取第1、3、10 代脂肪干细胞以1×107 L- 1 的密度接种于96 孔培养板内, 每板设3 个复孔, 200 μL/ 孔, 同时设空白对照孔, 每孔加入200 μL DMEM+10%胎牛血清培养基, 37 ℃、体积分数0.05 的CO2 饱和湿度下孵育24 h 后, 每24 h 取出1 个 96 孔板, 每孔中加入5 g/L 的MTT 10 μL, 在相同条件下继续培养4 h, 取出96 孔板, 离心后弃去培养液, 每孔加入二甲基亚砜200 μL, 在空气浴振荡器振荡混匀10 min, 充分溶解细胞代谢产物, 酶标仪测定490 nm 波长处的吸光度值, 连测3 次, 直至细胞铺满孔底。取5 孔吸光度的均值, 绘制生长曲线。

  用流式细胞仪对第3 代细胞表面特异性抗原进行检测。0.25% 胰蛋白酶+0.02% EDTA 消化待检细胞, 收集细胞, 1 200 r/min 离心5 min。用培养液调整细胞的浓度1.5~3× 109 L-1, 吸取1 mL 细胞悬液加入1.5 mL eppendorf 管中, 离心, 将沉淀细胞用100 μL 0.5%BSA 重悬, 加入一抗CD105、CD44、 CD34, 4 ℃孵育30 min, 离心, 磷酸缓冲液冲洗, 需间标的抗体, 加荧光标记Ⅱ抗, 4 ℃孵育 30 min。分别设实验组和空白对照组。每组标本3 份, 取平均值。

  主要观察指标:

  ①脂肪干细胞原代及传代培养细胞观察。

  ②四甲基偶氮唑蓝检测脂肪干细胞生长曲线。

  ③流式细胞仪检测脂肪干细胞表面标志。





我要咨询
更多>>专家推荐
  • 葛汝村简介

    葛汝村简介

    发育生物学专家,山东省交通医院细胞治疗中……

  • 李芳

    李芳

    儿科主任,主任医师,全军儿科专业委员会委……

  • 吕涌涛简介

    吕涌涛简介

    山东省交通医院副院长,主任医师,硕士生导……

更多>>权威医院

| 设为首页 | 加入收藏 | 联系站长 | 粤ICP备07073042号 | 友情链接 | 版权申明 | 联系我们 |

特别声明:本站内容仅供参考,不作为诊断及医疗依据。 本站所有内容严禁转载,转载需和管理员联系。

互联网医疗卫生信息服务许可证[粤卫网审字(2008)第17号] 常年法律顾问机构:北京市中伦金通律师事务所。