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胚胎大鼠神经干细胞培养方法的改进

录入:linle    文章来源:网络    点击数:    更新时间:2012-1-30

  分别以DMEM/ F12、2%B27、2 0 ng/ ml 的碱性成纤维细胞生长因子、20 ng / m l 的表皮生长因子无血清培养液和5%胎牛血清培养液预先培养大鼠神经干细胞( NSCs) 2~3 d 后, 换为无血清培养液; 应用倒置显微镜和免疫细胞化学法对其进行观察和比较。结果用含胎牛血清培养液培养的NSCs 聚球速度较无血清培养液明显加快, 可提前3~4 d 观察到NSCs 球。细胞染色证实细胞系巢蛋白阳性, 经血清培养液诱导分化后部分呈抗神经元特异性烯醇化酶( NSE ) 阳性, 部分呈抗胶质纤维酸性蛋白阳性, 表明可分化为神经元和胶质细胞。认为含血清培养液预先培养可以加快细胞培养速度, 是获得NSCs 的经济有效方法。

  许多研究证实, 胚胎和成年哺乳动物脑内均存在神经干细胞( N SCs) ; 在一定条件下, NSCs 可向多个方向分化, 成为神经元和神经胶质细胞。内源性干细胞自身修复和外源性干细胞移植以及基因治疗有可能实现对神经系统疾病结构与功能的重建, 故本实验意在寻求一种快速便捷的NSCs 原代培养方法。

  1 材料与方法

  1. 1 实验动物及试剂 Wistar 孕大鼠( 12~16 d) , 购自青岛市动物实验中心。DMEM/ F12( 1∶1) 细胞培养液及B27( Gibco 公司) ; 碱性成纤维细胞生长因子( bFGF) 、表皮生长因子( EGF) 、多聚赖氨酸、胰蛋白酶( 天津灏洋生物制品科技有限公司) ; 胎牛血清 ( PAA Gold 公司) ; 抗巢蛋白( Nestin) 抗体、抗胶质纤维酸性蛋白( GFAP) 抗体、抗神经元特异性烯醇化酶( NSE ) 抗体、抗5-溴脱氧尿核苷( Br dU ) 抗体、 SABC 免疫组织化学试剂盒( 博士德公司) ; 其余试剂均为国产分析纯。

  1. 2 原代取材及传代培养 取妊娠大鼠1 只, 麻醉后放入75% 酒精浸泡5 min, 无菌取出胎鼠脑组织, 用D-Hank's 液洗3 次, 剪刀剪碎, 200 目滤网研磨过滤。1 000 r/ min、3 min 离心2 次, 去上清。加 DMEM/ F12 制成细胞悬液。滤液( 细胞密度约1× 106 个细胞/ ml) 分别接种入4 个50 ml 细胞培养瓶, 分为四组。第1、2 组加入DMEM/ F12、2%B27、20 ng/ ml 的bFGF、20 ng/ ml 的EGF 无血清培养液, 第 3、4 组加入DMEM/ F12、5 %胎牛血清, 2~3 d 后分别换为无血清培养液。37 ℃、5% CO2 培养箱培养, 每3~4 d 半量换液1 次。神经细胞球密度较高时( 6 ~7 d) 机械分离神经球并传代, 传代后仍每3~4 d 半量换液, 直到再次传代。

  1. 3 免疫细胞化学反应 四组神经干细胞球传2 代后, 部分取出至预先涂有多聚赖氨酸的24 孔培养板, 继续无血清培养24~48 h, 吸去孔中液体, 4% 多聚甲醛室温固定30 min, 用30% H2O2 1 份+ 纯甲醇 50 份的混合液灭活内源性过氧化物酶, 5%BSA 封闭液20 min 封闭非特异反应。加入Nest in 一抗( 稀释度按各公司产品说明) , 37 ℃孵育1 h, 生物素标记的二抗IgG 和试剂SABC 各孵育20 min, DAB 呈色, 光学显微镜观察。

  1. 4 神经干细胞诱导分化及增殖能力的鉴定 四组神经干细胞球传3 代后, 移出至24 孔培养板, 部分孔内滴加适当稀释的BrdU, 均以含10% 胎牛血清的 DMEM/ F12 培养液分别诱导其分化。在诱导分化后的3~5 d, 4% 多聚甲醛室温固定后进行免疫细胞化学检测, 方法与Nest in 检测基本相同。其不同的是用抗NSE 抗体检测神经元, 用抗GFA P 抗体检测星形胶质细胞, 用抗BrdU 抗体检测细胞增殖能力。

  2 结果

  2. 1 免疫细胞化学反应情况 四组神经球Nest in 免疫细胞化学染色显示大多数细胞表达NSCs 的特征性标志抗原Nest in, 免疫染色呈阳性反应, 即神经球呈鲜艳的棕**。第1、2 组的克隆球与第3、4 组相比, 球体较小, 数量基本无差异。

  2. 2 神经干细胞诱导分化及增殖能力 神经球转入含血清培养液的24 孔板, 24 h 后大部分贴壁; 可见有单个细胞从神经球内游出, 贴壁生长, 分散存在, 可向四周发出放射状条索, 与周围细胞互相联接。2 d 后突起不断增粗和伸长, 形态不规则; 5 d 左右克隆基本分化成形态不一, 分散成突起多少不等的三种类型细胞: 􀀁 细胞体呈圆形或椭圆型、突起少但很长、折光性强的神经元样细胞, NSE 免疫染色呈阳性反应, 表明神经干细胞已部分分化为神经元; 􀀁胞体较大、突起较多较粗、细胞数量较多的星形胶质样细胞, 其折光性弱, GFAP 免疫染色呈阳性反应; 􀀁 细胞胞体最小, 数量也最少, 具有多个细胞突起, 突起较短、较细、且不断分枝, 考虑为少突胶质细胞样细胞。NSCs 由BrdU 掺入后, 分化培养的细胞中大多数显微镜下可见Br dU 免疫染色阳性。

  3 讨论

  20 世纪90 年代初期, Renolds[ 1] 等在成年鼠和胎鼠脑组织中分离出NSCs 以来, 10 多年的研究表明NSCs 不仅有很强的增殖与分化能力, 而且还有潜在的迁移能力, 因此NSCs 移植有可能成为神经系统治疗的有效手段。本实验就是利用其强大的增殖能力进行原代NSCs 的培养, 分别以DMEM/ F12、2% B27、2 0 ng/ ml 的bFGF、2 0 ng/ ml 的EGF 无血清培养液和血清培养液预先培养2~3 d 后, 换为无血清培养液, 经免疫细胞染色证实细胞系巢蛋白阳性。 Nest in[ 2] 起始表达于神经胚形成时, 但随着神经细胞分化的完成而停止表达, 被广泛应用于NSCs 的鉴定。BrdU 可掺入DNA 中, 呈阳性反应, 说明其可分裂增殖。这些细胞在培养基中不断增殖且形成细胞克隆, 经血清培养液诱导分化后部分呈N SE 阳性, 部分呈GFAP 阳性, 表明可分化为神经元和胶质细胞, 以上均证实所培养细胞为增殖活跃的NSCs。与历俊华等[ 3] 的研究结果相似, 本文第3、4 组在应用无血清培养液之前应用含5%胎牛血清的DMEM/ F12 培养液培养2~3 d, NSCs 的聚球速度明显加快, 较无血清培养液培养可提前3~4 d 观察到NSCs 球, 其体积较第1、2 组明显增大, 诱导分化后与直接用无血清培养液培养的NSCs 无明显差异, 说明含血清培养液预先培养可以加快细胞培养速度, 并相对节省经费, 不失为获得大量NSCs 用于移植治疗的经济有效方法。





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