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人骨髓间充质干细胞及其在脑缺血的应用

录入:linle    文章来源:网络    点击数:    更新时间:2012-2-21

  近年来研究发现人骨髓间充质干细胞在适宜的条件下可向神经细胞分化, 并对脑缺血性疾病的神经功能缺损有明显的改善作用。本文就人骨髓间充质干细胞的取材来源、分离培养、细胞表面标记、神经细胞方向分化潜能及其在脑缺血性疾病应用方面的研究进展作了综述。

  关键词: 骨髓间充质干细胞; 神经细胞; 脑缺血; 移植

  干细胞是一群具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞。随着细胞学、分子生物学等基础医学的飞速发展和应用, 人们逐渐认识到干细胞移植在治疗心、脑血管疾病, 肝脏、角膜疾病, 糖尿病等方面具有广阔的前景。近年来, 研究用于治疗脑缺血性疾病的干细胞主要有以下三种: 胚胎干细胞 ( embryon ic stem cells, ESCs ) 、神经干细胞( neural stem cells, NSCs ) 、骨髓间充质干细胞( mesenchym al stem cells, MSCs ) 。与胚胎干细胞和神经干细胞相比, MSCs具有以下优点: 􀀁 取材方便, 分离获取容易; 􀀁 在体外扩增迅速, 具有多向分化潜能; 􀀁 是来自中胚层的早期细胞, 免疫源性弱; 􀀁可避免伦理学方面的争议等。除此之外, 人骨髓MSCs 可从自身骨髓提取, 作为细胞移植的供体对损伤的细胞和组织进行替代、修复还可以避免组织配型及免疫排斥等问题, 因此, 越来越多的研究者开始关注人骨髓M SCs。

  1􀀁 人骨髓间充质干细胞的取材来源骨髓间充质干细胞又称骨髓基质细胞( bone m arrow strom al cells, BM SCs) , 是存在于骨髓中的非造血干细胞的另一种干细胞。目前人骨髓MSCs 的取材来源主要有如下几种: 􀀁 健康志愿者捐献的骨髓; 􀀁 临床上需做骨穿的患者抽取的骨髓( 经患者或其家属同意) ; 􀀁 外科手术中的弃骨( 非血液系统及恶性肿瘤患者) : 包括肋骨、髂骨等。另外有文献报道人股骨[ 1] 及胚胎来源的骨髓[ 2] 。

  2􀀁 人骨髓间充质干细胞的分离、培养骨髓中M SCs 的数量极少, 仅占骨髓单核细胞的0. 001% ~ 0. 01% , 且随着年龄的增加, 细胞数量逐渐减少, 如何获取高纯度的MSCs 相当重要。目前常用的分离M SCs 的方法主要有三种: 密度梯度离心法、贴壁筛选法和流式细胞仪分选法。􀀁 密度梯度离心法是根据骨髓中细胞成分比重的不同, 利用细胞分离液通过离心分层, 将有核细胞和血细胞分离的方法。􀀁 贴壁筛选法即根据MSCs 的粘附贴壁生长而血细胞在培养液中悬浮生长的特性上的差异, 通过定期换液除去不贴壁细胞, 从而达到纯化MSCs 的目的。􀀁 流式细胞仪法是利用免疫学方法应用流式细胞仪识别标记了的MSCs 表面标志, 将所需细胞进行分离的方法。由于此方法试剂、仪器价格昂贵, 技术要求较高而且分选过程中可造成细胞损伤和死亡、经过此法分选的细胞出现增殖缓慢等问题, 目前尚未广泛应用。在实际工作中, 多数研究者前两种方法联合应用。此外, 还有人提出免疫排除法、免疫磁珠法、微孔过滤法、阳性低亲和力神经生长因子受体筛选法等。

  MSCs 的培养目前多采用贴壁细胞培养法。 M us ina等[3] 从健康志愿者的髂骨中抽取10~ 15 m l 骨髓, 以PBS 按1 􀀁 1 比例稀释, 用F icoll-Paque 分离液10􀀁 下400 g 离心30 m in, 收集中间细胞层 PBS 液洗过后, 室温下200 g 离心10 m in, 再用160 mM 的NH 4CL 洗去红细胞, 以1 􀀁 106 / cm2 的密度接种于L-DMEM 培养基( 含有10% FBS, 2 mM 谷氨酰胺, 1% 青霉素和链霉素) 中标准条件( 37􀀁 , 5% CO 2) 下培养, 3 ~ 4 d 更换培养液, 细胞达到80% 融合后以0. 25% 胰蛋白酶/EDTA 消化后传代。他们的实验显示, 人骨髓MSCs 的生长潜伏期为24~ 48 h, 原代细胞达到80% 融合的时间约为2 ~ 3 周, 细胞大小不一( 10 ~ 300 􀀁m ) , 形态多样( 梭状细胞、成纤维细胞样细胞及外膜细胞等) , 培养3 个月内, 细胞生长情况相似。

  3􀀁 人骨髓间充质干细胞的细胞表面标记物 MSCs 目前还没有特异性的表面标记物, 对 M SCs 的鉴别尚无统一标准。MSCs 为非造血系干细胞, 不表达造血细胞表面抗原( 如CD10、CD31、 CD 34、CD 38、CD 45、CD11a、CD14 ) , 其表达阳性的细胞表面标志物有CD13、CD 29、CD 44、CD54、 CD 90, CD105、CD106、CD 166 等[ 3-5] 。另外, MSCs 还可表达SH-2、SH- 3 和SH-4[ 6] 。Rom anov 等[ 7] 用流式细胞荧光法及组织学染色法检测到人M SCs 还表达HLA- I 标记物􀀁 􀀁 􀀁 波形蛋白( vmi entin ) 、抗平滑肌抗体( ASMA ) 、I-型胶原( co llagen-1 ) 及纤维结合蛋白( fibronectin ) 染色为阳性, 但不表达HLADR 、CD 117 及造血细胞表面标志物。

  4􀀁 人骨髓间充质干细胞向神经细胞方向分化以往的观点认为, 神经细胞属于终末分化细胞, 神经系统受损伤后无法通过神经细胞的再生而得以恢复。干细胞的发现使人们对神经再生有了新的认识。近年来许多实验表明在适当的条件下, 人骨髓MSCs能向神经细胞方向分化。

  Qu等[ 8] 的研究发现用BrdU 预处理3周的**骨髓来源的MSCs 在体外及成年大鼠体内均能分化为神经细胞及视网膜细胞。H erm ann 等[ 9] 发现** M SCs 能向神经干细胞样细胞转化, 以神经球样方式生长并且高表达早期神经外胚层标志物( 如 NeuroD1、Neurog2、MSl1、otx1、nestin ) , 这些细胞能分化为三种主要的神经细胞: 星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。Long 等[ 10] 在体外用神经分化培养基培养人骨髓M SCs ( 第三代) , 培养6 d 后进行细胞计数, 免疫荧光染色和RT-PCR 检测其神经细胞标志物的表达, 发现66% 的细胞呈现为典型的神经细胞形态, 一些细胞表达早期神经细胞标志物( Nestin、beta- tubulin III) 和成熟神经细胞及神经胶质细胞标志物( NF、NeuN、Tau、Nurr1、GABA、 GalC、GFAP ) 。T ao 等[ 11] 发现人MSCs 低水平表达神经细胞标记物NF-M、beta tubulin III和NSE, 在无血清的条件下神经营养因子如基本的成纤维细胞生长因子( bas ic fibroblast grow th factor, bFGF ) 、表皮生长因子( epiderm al growth factor, EGF ) 、血小板衍生的生长因子( platelet- derived grow th factor, PDGF ) 能诱导MSCs 向神经细胞形态变化, 这些细胞还表达神经递质或相关蛋白( 如􀀁-氨酪酸、酪氨酸羟化酶、5-羟色胺) 。

  尽管他们的研究方法有所不同, 但在诱导后都检测到了神经细胞的一些特异性标志物, 这说明在适当的条件下, 人骨髓MSCs 能向神经元和神经胶质细胞等分化, 可以在体外经过扩增诱导后作为神经细胞移植的供体, 为神经系统疾病的治疗开辟了一条新的途径。





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