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胚胎干细胞转录因子Nanog 研究进展

录入:linle    文章来源:网络    点击数:    更新时间:2012-2-21

  摘要胚胎干细胞( ES 细胞) 的生物学功能由众多复杂的信号转导网络调控, 其中保持ES 细胞未分化状态的调控途径备受瞩目。Nanog 是最新发现的一个在维持ES 细胞自我更新和保持全能性中发挥重要作用的转录因子, 独立于白血病抑制因子( leukemia inhibitory factor, LIF) 途径和骨形成蛋白( bone morphogenetic protein, BMP) 途径, 与OCT4, SOX2 共同位于细胞全能性调控网络的顶端。就Nanog 因子的结构、表达调控以及与生殖细胞肿瘤的关系作如下综述。

  关键词胚胎干细胞Nanog 未分化生殖细胞肿瘤胚胎干细胞( embryonic stem cells, ES 细胞) 是指从胚胎内细胞团或原始生殖细胞筛选分离出的具有多能性或全能性的细胞。ES 细胞的一个显著特性就是能够以一种自我更新的未分化的状态来无限地保持自我, 因此使得ES 细胞在再生医学、组织工程、药物研制、基因功能等研究领域的重大价值得以体现。目前关于ES 细胞保持未分化调控网络的研究主要有以下几条途径: ①白血病抑制因子 ( LIF) /STAT3 途径。②OCT3/4 途径。③Nanog 途径。 ④骨形成蛋白(BMP) 途径。⑤Wnt 途径。

  以往认为, LIF/STAT3 途径是ES 细胞自我更新所必需的。但有证据与此观点相反: 许多非ES 的其他类型细胞STAT3 途径也被激活; 缺失LIF/STAT3表达的胚胎也可得到正常的内细胞团; 鼠ES 细胞系在无LIF 的情况仍可自我更新。这些都说明存在另一不依赖STAT3 途径的而使ES 细胞维持其特性的基因。2003 年Chambers 等[1]和Mitsui 等[2]分别报道发现了一个新的转录因子Nanog, 意为“神秘的永远年轻的土地Tirnanog”。Nanog 在维持ES 细胞全能性中是必需的, 在内细胞团( inner cell mass, ICM) 、 ES 细胞和胚胎生殖细胞( embryonic germcells, EG) 中都有表达, 而在已分化的细胞和成体组织中不再表达[3]。近来, 研究表明Nanog 与生殖细胞肿瘤关系密切, 作为肿瘤发生有价值的分子标记更是引起了广泛关注[4]。

  Nanog 的结构

  Nanog 属于ANTP 类, NK 家族基因, 在人定位于12 号染色体12p13.31, 大小为7.84 Mb。Nanog 的 cDNA 由2 184 个核苷酸组成, 包含一个开放阅读框, 编码305 个氨基酸, 分为3 个区域: homeodomain 发挥蛋白之间相互作用及DNA 结合的作用; 氨基末端富含丝氨酸和苏氨酸, 可能与磷酸化作用有关; 羧基末端包含明显的W重复序列。氨基末端和羧基末端尽管没有明显的转录基序但均有转录活性, 羧基末端结构域的活性是氨基末端的7 倍。通过EST 确认Nanog 基因有4 个外显子, 所有的结合位点均遵从GT-AG 供受原则。同源盒位于外显子2 和外显子 3, 44 号和45 号homeodomain 残基之间[5]。Nanog 的 mRNA 序列尚未在DNA 水平上确定。

  Nanog 在小鼠和人ES 细胞中均存在, 其同源域在不同品系小鼠中94%相同, 在不同人种中87%相同。人Nanog 共有11 个假基因, 鼠Nanog 有2 个假基因[5]。即一类无编码DNA 序列, 在表面上与功能基因相似, 但由于许多突变以致失去了原有的功能, 其中一部分能明显阻止基因发挥正常的功能。Fairbankt 等[6]通过对比人与黑猩猩Nanog 基因及其假基因发现: 人Nanog 基因及除Nanog 8 外所有假基因在染色体的位置与黑猩猩相同, 而Nanog 8 在黑猩猩基因组中缺失, 是人在进化后出现的最新的一个假基因, 并推测Nanog 假基因家族在进化中由早及近顺序为: Nanog6,Nanog5,Nanog3,Nanog10,Nanog2, Nanog 9, Nanog 7, Nanog 1 和Nanog 4。最近研究表明ES 细胞特异性表达的基因( 如Nanog, STELLA 和OCT4) 具有的假基因数量远超过其他组织特异性基因, 假基因数量也许可成为ES 细胞特异性基因的标记[7]。

  Nanog 与分化抑制

  早期胚胎发育的表达发现[3, 8]: Nanog 在早期卵裂阶段没有明显表达, 首先能检测到其mRNA 的时期是桑葚胚阶段, 到了早期囊胚, Nanog 的表达只限于ICM, 在滋养外胚层没有表达, 晚期囊胚时其 mRNA 进一步只出现在上胚体而在原始内胚层中不存在。一旦胚胎附植开始后, Nanog 的mRNA 只出现在上胚体区域, 其中近前端表达水平最高, 进入原条期表达开始迅速减少。妊娠期9~13 d, 在迁移中 PGC 和到达生殖嵴的PGC 也同样检测到Nanog mRNA 的存在, 于孕11.5 d 小鼠胚胎的生殖嵴中就明显发现了其mRNA。Nanog 基因引起ES 细胞向体壁和内脏方向的内胚层分化。Darr 等[9]研究表明, 在 Nanog 过表达的情况下人ES 细胞可以在无饲养层的条件下保持全能性传代。Nanog 抑制分化的一个机制可能是抑制了一些促分化基因如gata4 和6 的转录。因为在ES 细胞中强制性表达gata4 和6 会使其向内胚层分化, 在gata6 过量表达的细胞和Nanog 缺失的细胞中, 其他标志基因的表达模式基本一样[10]。 gata6 是gata4 的上游基因, gata6 直接影响gata4。 Mitsui 等[2]通过SELEX 选择确认gata6 增强子区域中包含一个Nanog 的DNA 识别序列, 表明Nanog 可能直接调控gata6。另外, Nanog 的共有序列在Rex21 的增强区域中发现, 显示Nanog 也可能通过调节一些ES 细胞特异性基因维持其全能性。

  Nanog 和OCT4, SOX2

  OCT4 属于POU 转录因子家族, 是调控ES 细胞自我更新的重要因子。其靶基因有成纤维细胞生长因子( FGF-4) 、未分化细胞转录因子1(Utf-1) 、锌指蛋白zfp42/Rex-1 等。OCT4 与许多ES 细胞特定基因的引物或增强子区域的特定序列结合, 在细胞自我更新中有两个相关因子, Sry 相关因子SOX2[11, 12] 和Forkhead Box 家族成员FoxD3, 其与OCT4 共同作用调节下游基因。

  在鼠的个体发生中Nanog 的表达稍晚于OCT4, 在桑葚胚、内细胞团和早期生殖细胞以及极早期外胚层中均有表达。Nanog 表达缺失的小鼠, 内细胞团可自发分化成内脏、体壁和腔室。OCT4 主要是在桑葚胚和滋养外胚层及内细胞团的形成中发挥作用, 而Nanog 是在第二阶段内胚层形成中起作用。 2005 年Kuroda 等[13]和Rodda 等[14]分别发现在 Nanog 的近端引物内存在OCT-SOX cis-调控元件复合物, 对Nanog 的多能性转录来说不可缺少。2005 年 9 月Boyer 等[15]通过基因组定位分析的方法揭示 Nanog, OCT4, SOX2 三个转录因子位于细胞全能性调控网络的顶端, 共同调控与全能性和自我更新, 以及分化有关的下游调控基因。实验表明, Nanog, OCT4 和SOX2 分别参与hES 细胞中1 687, 623 和 1 271 个已知编码蛋白基因启动子的构成, 其中至少 353 个基因由Nanog,OCT4 和SOX2 共同调控。353 个基因中约一半被转录激活, 参与编码转录因子( 如: OCT4, SOX2, Nanog, STAT3 和ZIC3) 和Tgf-β( 如: TDGF1, LEFTY2/EBAF) 及Wnt( 如: DKK1, FRAT2) 信号途径的构成, 而被转录抑制基因中富集参与发育过程, 在分化中起重要作用的基因( 如:ESX11,HOXB1, MEIS1,PAX6,LHX5,LBX1,MYF5和ONECUT1);Nanog, OCT4 和SOX2 与14 个miRNA 有关系, 共同调控至少2 个miRNA: mir-137 和mir-301, 而先前研究表明ES 细胞缺少miRNA 的转录将不能分化, miRNA 在调控基因表达向组织分化中起重要作用; 同时 Nanog, OCT4 和SOX2 联合形成调节通路, 包括自动调节通路和反馈通路, 自动调节被认为对缩短对外界刺激的反应时间, 增加基因表达的稳定性有利, 而反馈调节包括正反馈和负反馈, 在保持细胞全能性, 对抗分化信号能力中发挥作用, 这两条通路是ES 细胞保持自身特性同时对分化做出适当反应的调节机制。





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