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兴奋性氨基酸抑制胎鼠神经干细胞的增殖

录入:linle    文章来源:网络    点击数:    更新时间:2012-3-1

  [摘 要] 目的: 研究兴奋性氨基酸对体外培养胎鼠神经干细胞( NSCs)增殖的影响。方法: 体外分离、培养与鉴定SD胚胎大鼠脑室下带( SVZ)神经干细胞, 利用MTT比色法测定兴奋性氨基酸N - 甲基- D - 天冬氨酸( NM􀀁 DA)和谷氨酸( G lu)对细胞增殖的作用。结果: 成功分离出具有胚胎源性的神经干细胞, NMDA和G lu均能导致神经干细胞的增殖活性下降。结论: 培养的SVZ区域细胞具有自我更新和多分化潜能, 是中枢神经系统干细胞, 兴奋性氨基酸能有效地抑制神经干细胞的增殖。

  自从1992年Reyno lds和We iss首先在成年小鼠纹状体中分离培养出能在体外不断增殖、具有多分化潜能的细胞群以来, 神经干细胞( neuro stem ce lls, NSCs) 诱人的运用前景激发了许多科学家的兴趣[ 1- 3] 。调控神经干细胞的增殖与分化一直是研究神经干细胞的两个重要方向, 本研究旨在观察兴奋性氨基酸谷氨酸( G lu)和N - 甲基- D - 天冬氨酸 (NMDA )对神经干细胞增殖的影响, 这对于深入研究兴奋性氨基酸在中枢神经系统发生中的作用具有一定的意义。

  材料和 方 法

  1 实验动物

  妊娠14 d SD大鼠由上海市计划生育研究所动物实验中心提供。

  2试剂

  DMEM /F12 ( 1􀀁1)和B27( G ibco)、碱性成纤维细胞生长因子( basic fibroblast grow th factor, bFGF ) ( Sigma)、胎牛血清(杭州四季青生物材料研究所) , 多聚赖氨酸、胰蛋白酶和EDTA ( Sigma)。抗巢蛋白 ( nestin), 抗MAP- 2、抗GFAP和抗CNP小鼠单克隆抗体, 均由Promega公司提供。MTT、NMDA 为S igma 公司产品, 谷氨酸为国产分析纯试剂。ABC 单标试剂盒和SABC免疫组化试剂盒由武汉博士德公司提供。

  3方法

  31 取材􀀁 经腹腔注1􀀁5% 戊巴比妥钠麻醉大鼠, 在无菌条件下取出全部胚胎, 用D- H anks液漂洗, 解剖显微镜下剥离脑膜, 取胚胎脑SVZ 区域, 1 000 r /m in离心5 m in收集细胞, 细胞重悬于含B27 和20 􀀁g /L bFGF的DMEM /F12 培养液, 以2 􀀁 10 8 ce lls/L 接种于玻璃培养瓶, 37 􀀁 、5% CO2 培养。

  32 神经干细胞的培养与鉴定􀀁 参照文献[ 2 ] 将上述培养7 d的细胞克隆机械分散, 采取有限稀释法悬浮培养, 培养液为DMEM /F12 + B27 + 20 ng bFGF, 过24- 48 h后出现单细胞克隆球团(大约50- 100 个细胞) , 连续传代培养。用抗nestin抗体检测克隆球团; 然后用10%胎牛血清诱导细胞分化, 采用免疫组化双标及单标法, 检测细胞的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性抗原, 鉴定细胞的多潜能分化特性[ 4] 。

  33 细胞增殖实验􀀁 将细胞悬液稀释成( 1- 5) 􀀁 107 cells/L, 接种于96孔细胞培养板中, 每孔200 􀀁L, 置37 􀀁 、5% CO2、100% 相对湿度的培养箱中培养 24 h 后, 分别加入不同浓度梯度谷氨酸和NMDA, 每个浓度组制备8个重复孔, 每隔24 h加1次药, 共加 3次, 不加药为空白对照组。 3􀀁4 􀀁 MTT法检测细胞增殖􀀁 取出培养板, 在各孔加 5% MTT 20 􀀁L, 继续培养4 h, 加入含10% SDS - 0􀀁01mo l/L HC l 100 􀀁L, 振荡5 m in后置于37 􀀁 恒温箱中过夜, 用酶标仪在570 nm下测定各孔吸光度 (A )值。

  4 统计学处理

  数据用xs表示, 采用SPSS软件进行统计学处理。

  结 果

  1 神经干细胞系的鉴定

  11 Nest in抗原表达􀀁 N estin免疫细胞化学检测结果显示, 单细胞克隆经分散、再扩增得到的大量神经球呈Nest in抗原阳性(图1)。

  12 多潜能分化特性􀀁 用免疫细胞化学方法, 可检测到经10% 血清诱导的3 种神经细胞: MAP - 2、 GFAP和CNP阳性细胞(图2、3、4)。

  2 兴奋性氨基酸对胎鼠神经干细胞增殖的作用

  实验结果显示, 不同浓度的谷氨酸和NMDA 对细胞增殖有显著的抑制效应(P < 0􀀁05, n = 8) (图5、 6)。随着谷氨酸浓度的增高对细胞增殖的抑制效应加强; NMDA 在0􀀁1- 100 mmo l/L 对干细胞增殖抑制也呈浓度依赖性变化, 而在0􀀁01 mmol /L时无显著抑制作用。

  讨 论

  本实验分离的细胞群具有很强的自我更新能力, 在连续传代培养中依然维持了克隆能力, 即使在传代20代后仍具有形成克隆的能力。克隆球团表达特殊标志蛋白nestin, 表明细胞具有胚胎源性[ 5] ; MAP- 2抗体为特异性识别神经元的核抗体, GFAP 为识别星型胶质细胞的胞浆抗体, 2- 3- 环核苷酸磷酸二酯酶( 2- 3- cyclic nucleotide- 3- phosphy t􀀁 dro lase, CNP)为少突胶质细胞的特异性抗原。经血清诱导分化后获得MAP - 2、GFAP 和CNP阳性细胞, 显示其具有多分化潜能。神经干细胞就是指具有分化为神经元细胞、星型胶质细胞和少突胶质细胞的能力, 能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞[ 6, 7] , 因此, 本实验分离的细胞群具有自我更新能力和多分化潜能, 具备了神经干细胞的基本属性, 属于神经干细胞。

  兴奋性氨基酸是脊椎动物中枢神经系统中具有广泛分布的一种神经递质。其中谷氨酸是脑内最重要的兴奋性神经递质, NMDA 在脑内的含量也很丰富而且与谷氨酸密切相关, 它对神经元也有去极化作用和兴奋作用, 其分子机制与谷氨酸能突触相似[ 8] 。自1969年O lney报道谷氨酸有神经毒性作用以来, 兴奋性氨基酸的类似物和拮抗剂不断涌现, 大大促进了兴奋性氨基酸的研究[ 9] 。兴奋性氨基酸的毒性作用可引起神经元退变或功能降低。在本实验中, 谷氨酸浓度在100 - 500 mmo l/L 对干细胞增殖的抑制效应显著, NMDA 浓度在0􀀁1 - 100 mmol /L 之间对干细胞增殖抑制呈一定的浓度梯度变化, 此浓度范围与Tana等[ 10 ] 研究NMDA 对体外培养的幼鼠神经细胞Ca2+ 内流促进效应的浓度一致。兴奋性氨基酸的毒性作用可能是通过以下两条途径产生的: 一是主要由氨基- 3- 羟基- 5- 甲基- 4- 异恶唑丙酸受体( AMPA - R )和海人藻酸受体( KA - R ) 过度兴奋所介导的神经细胞急性渗透性肿胀, 以 N a+ 内流为特征, 可在数小时内发生; 二是主要由 NMDA- R过度兴奋所介导的神经细胞延迟性损伤, 以Ca2+ 内流为特征, 可在数小时至数日后发生。据邓小明[ 11] 报道, 在大多数病理情况下, NMDA - R 介导的神经细胞延迟性损伤可能起主要作用。因此, 细胞内钙离子超载可能是谷氨酸和NMDA 引起细胞损伤或死亡的共同病理学机制。

  研究神经干细胞的核心问题之一, 是在体外调控干细胞的分裂增殖。在神经干细胞增殖过程中, 除了必需的营养物质及一些促分裂因子如碱性成纤维细胞生长因子( bFGF)或表皮生长因子( EGF)外, 还有其它氨基酸类递质及肽类物质参与调控[ 12 ] 。兴奋性氨基酸既有神经递质功能又参与代谢, 可引起神经元持续去极化, 干扰神经元的调节机制。本研究利用MTT 法观察谷氨酸和NMDA 这两种兴奋性氨基酸对神经干细胞增殖的影响。结果提示, 兴奋性氨基酸在抑制干细胞增殖方面发挥作用, 为进一步了解兴奋性氨基酸在中枢神经系统的发生、发育中的作用及它们的致病机制提供依据。





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